Pluriempleo de la familia Arabidopsis molibdato transportador 2 y GSH

Jul 17, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 801 (2023) Citar este artículo

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El molibdeno (Mo) como micronutriente esencial para las plantas, actúa como componente activo del cofactor de molibdeno (Moco). Los procesos metabólicos centrales, como la asimilación de nitratos o la biosíntesis del ácido abscísico, dependen de enzimas dependientes de Moco. Aunque hasta la fecha se conoce una familia de proteínas transportadoras de molibdato (MOT1) en Arabidopsis, la homeostasis del molibdato sigue sin estar clara. Aquí informamos sobre una segunda familia de transportadores de molibdato (MOT2) que desempeñan un papel clave en la distribución y el uso de molibdato. Los análisis de fenotipo de KO, la localización celular y específica de órganos y la conexión con las enzimas de biosíntesis de Moco a través de la interacción proteína-proteína sugieren una participación en la importación celular de molibdato en las hojas y los órganos reproductivos. Además, detectamos un complejo glutatión-molibdato, que revela cómo se mantiene el almacenamiento vacuolar. Recientemente se informó de una supuesta función de transporte de S-adenosil-metionina en Golgi para la familia MOT2. Aquí, proponemos una función de pluriempleo, ya que se encontró evidencia clara de transporte de molibdato en un sistema de levadura. Nuestra caracterización de la familia MOT2 y la detección de un complejo de glutatión-molibdato revelan la forma en que el molibdato se extiende a toda la planta.

La mocobiosíntesis es crucial para la funcionalidad de las enzimas dependientes de Moco (Mocoenzimas), elementos clave de las rutas metabólicas básicas en planta1. El proceso de cuatro pasos involucra seis enzimas y se conserva en todos los reinos de la vida2. La inserción de molibdato en la molibdopterina se mantiene mediante la molibdeno-insertasa Cnx1 (cofactor de la nitrato reductasa y la xantina deshidrogenasa 1) que actúa en un complejo multienzimático3. La nitrato reductasa (NR) del usuario clave de Moco cataliza el primer paso de la asimilación de nitrato4. Las mocoenzimas participan, entre otras cosas, en la biosíntesis del ácido abscísico (ABA) mediante la aldehído oxidasa abscísica (AAO)5 y en la detoxificación del sulfito mediante la sulfito oxidasa6.

La absorción eficiente de molibdato (MoO42-) y su distribución desde el suelo hacia las células es esencial para la biosíntesis de Moco en las plantas y se mantiene mediante proteínas transportadoras de molibdato (MOT) especializadas7. Se cree que existen dos familias MOT independientes8,9; sin embargo, hasta la fecha solo se han caracterizado miembros de la familia MOT1, que desempeñan funciones fisiológicas distintas en la biosíntesis de Moco7.

MOT1.1 (anteriormente conocida como MOT17; AT2G25680) es una proteína de la membrana plasmática (PM) con una actividad de transporte de molibdato de alta afinidad (Km de 20 nM)10 y se produce de manera más prominente en las raíces11. Por lo tanto, MOT1.1 funciona como importador de molibdato radicular del suelo, pero no participa en la importación de células de la hoja ni en la entrega de molibdato al complejo de biosíntesis de Moco. El MOT1.2 altamente relacionado y localizado en tonoplastos (anteriormente conocido como MOT27; AT1G80310)12 es el segundo miembro de la familia MOT1. Controla la liberación de molibdato almacenado desde la vacuola mediante interacción directa con Cnx17.

A pesar de las funciones informadas de los miembros de la familia MOT1, dos mecanismos aún no están claros para comprender completamente la homeostasis del molibdato en las plantas: (i) cómo el molibdato ingresa a las células de las hojas y las semillas y (ii) cómo se importa a la vacuola. Es posible que los miembros de la segunda familia MOT se encarguen de estas tareas.

La familia MOT2 independiente y no relacionada se descubrió por primera vez en Chlamydomonas reinhardtii8. CrMOT2 mostró actividad de absorción de molibdato de alta afinidad (Km de 550 nM) cuando se produjo de forma heteróloga en levadura. Los ortólogos de genes están presentes en la mayoría de los eucariotas, incluidos los animales8 y las plantas superiores como Oryza sativa13. Aunque se postuló la presencia de tres miembros de la familia MOT2 en Arabidopsis thaliana (A. thaliana)8,9, hasta el momento no se ha demostrado una función MOT para esta familia9,14.

Recientemente, la familia MOT2 de Arabidopsis se asoció con una supuesta función adicional de importación de S-adenosil metionina (SAM) en el aparato de Golgi para la metilación de polisacáridos, necesaria para la correcta biosíntesis de la pared celular14.

Aquí informamos la identificación de cuatro miembros de la familia MOT2 en A. thaliana y mostramos su actividad de transporte de molibdato. La localización de PM y la interacción con la insertasa de molibdeno Cnx1 revelan su papel como importadores de molibdato. Debido a la función adicional como importadores de Golgi-SAM, postulamos un carácter de pluriempleo. Nuestros hallazgos sobre la expresión global de un miembro de la familia MOT2 y su importancia para el usuario clave de Moco NR muestran su papel fundamental en la distribución de molibdato y la importación celular para suministrar directamente la biosíntesis de Moco. Los miembros restantes de la familia MOT2 se producen en las flores y se sugiere un papel en la maduración de las semillas y el polen. Detectamos un complejo glutatión-molibdato, lo que muestra cómo funciona el almacenamiento vacuolar de molibdato. En conjunto, nuestros hallazgos describen la forma en que el molibdato se utiliza en toda la planta desde su absorción, distribución, almacenamiento y uso en la biosíntesis de moco.

En Chlamydomonas reinhardtii hay dos familias MOT que constan de un miembro cada una: CrMOT115 y CrMOT28. Según su homología con CrMOT2 se identificó la proteína AtMOT2.1 de A. thaliana codificada por el gen AT4G277208. Las proteínas codificadas CrMOT2 y AtMOT2.1 comparten una similitud de aminoácidos (aa) del 71% y contienen cuatro motivos altamente conservados característicos de las proteínas MOT2 (Fig. 1a). En un análisis filogenético, Huang et al.9 identificaron dos genes más relacionados con mot2 en A. thaliana: Atmot2.2 (AT1G64650) y Atmot2.3 (AT3G49310). Los análisis de las proteínas codificadas revelaron una similitud de secuencia de más del 83% en el nivel aa, mostraron su asociación con la superfamilia de facilitadores principales y, lo más importante, identificaron cuatro motivos específicos de MOT2 (Fig. 1a). mot2.2 codifica dos proteínas: MOT2.2 A consta de 462 aa y su variante de empalme MOT2.2B que carece de los primeros 41 aa. MOT2.3 consta de 460 aa.

una alineación ClustalW de secuencias MOT2 de Chlamydomonas reinhardtii (Cr) y A. thaliana (At). Los aa idénticos están marcados en gris oscuro, similares en gris claro y diferentes en blanco. Cuatro dominios altamente conservados están marcados con cuadros rojos. b Curva de crecimiento representativa de levaduras Moco en medio de clorato de molibdato con expresión de mot1.1 inducida (negro; +Gal) y no inducida (gris; –Gal). El índice de biomasa de 40 RLU está marcado con una línea de puntos roja. c Tiempo en horas para alcanzar un índice de biomasa de 40 RLU de levaduras Moco con expresión de mot inducida (negra; +Gal) y no inducida (blanca, –Gal). Se traza la media de dos experimentos independientes y las barras de error representan la desviación estándar. Se utilizó la prueba T no apareada para probar la significancia. **P ≤ 0,01; ***P ≤ 0,001. d Clasificación según el tiempo para alcanzar el índice de biomasa de 40 RLU de levaduras Moco con expresión de mot inducida como se indica. El comportamiento de crecimiento se normalizó con respecto a los controles sin clorato. Los datos cuantitativos en la Fig. 1c se analizaron adicionalmente mediante ANOVA de dos vías y la prueba post hoc de Sidak para comparación múltiple (Tabla S2).

La función de transporte de molibdato de la familia MOT2 se probó mediante un ensayo de crecimiento in vivo basado en levaduras. La Saccharomyces cerevisiae de tipo salvaje (WT) carece de genes relacionados con el metabolismo del molibdeno, incluidos los MOT16. Los genes fúngicos que codifican la biosíntesis de Moco y la NR derivados de Neurospora crassa se integraron en el genoma de la levadura (Tabla S1) siguiendo el enfoque de Perli et al.17, y tanto la biosíntesis de Moco como la actividad de NR se detectaron cuando la coexpresión de genes candidatos mot se indujo en medios de crecimiento que contenían una cantidad fisiológica de molibdato 100 nM.

Como siguiente paso, se realizó un ensayo de crecimiento in vivo con las cepas de levadura Moco. La NR no sólo reduce el nitrato a nitrito sino también el clorato a clorito citotóxico18,19. Cuando los candidatos a mot coexpresados ​​son capaces de transportar activamente molibdato, las levaduras Moco se vuelven más sensibles al clorato debido a la biosíntesis funcional de Moco que produce NR activo capaz de producir clorito citotóxico. La inhibición del crecimiento resultante se puede cuantificar utilizando un analizador de crecimiento BioLector®.

Las levaduras Moco que expresan mot1.1 como control positivo (Fig. 1b) mostraron un crecimiento significativamente deficiente en presencia de clorato y molibdato cuando la expresión génica fue inducida por galactosa. Los análisis de mot1.2 y todos los candidatos a mot2 (Fig. 1c) revelaron una inhibición significativa del crecimiento después de la inducción de galactosa comparable al control positivo. Por lo tanto, la expresión inducida de todos los candidatos mot2 probados causó una inhibición del crecimiento dependiente del transporte de molibdato basada en la producción de clorito citotóxico debido a una mayor actividad de NR. Además, se observó un orden aparente de capacidad de transporte de molibdato (Fig. 1d). MOT1.1 y MOT1.2 mostraron la mayor capacidad, seguidos de MOT2.3, MOT2.2B, MOT2.2 A y MOT2.1.

La localización intracelular de MOT2 se aclaró mediante microscopía de fluorescencia en protoplastos mesófilos de Nicotiana benthamiana (N. benthamiana). Todas las construcciones Venus-MOT2 fusionadas en el extremo N-terminal no mostraron señales o solo fueron débiles. En consecuencia, solo se analizaron construcciones MOT2-Venus fusionadas en el extremo C-terminal. Todos los miembros de la familia MOT2 se localizaron de manera similar como una capa delgada que rodea el protoplasto en su periferia (Fig. 2). La coexpresión con el marcador de citosol eqFP611 (Fig. 2a1 – d1) mostró una clara diferenciación de las señales, mientras que se observó colocalización con el marcador PM AtPIP2A20 (Fig. 2a2 – d2), lo que indica la localización PM de MOT2. Además, se detectó fluorescencia en estructuras similares a vesículas. Un experimento de localización adicional en plántulas de A. thaliana verificó la localización de PM y mostró colocalización con el marcador cis-Golgi GmMan-121 (Fig. S2).

a – d Transformación química transitoria de protoplastos mesófilos de N. benthamiana con construcciones de fusión MOT2-Venus y coexpresión de eqFP611 como marcador citosólico (a1 – d1) o AtTPIP2A-RFP como marcador PM (a2 – d2). Las imágenes son una combinación de los canales de detección de Venus (amarillo), autofluorescencia del cloroplasto (rojo) y marcador (eqFP611 en azul, a1-d1; AtPIP2A-RFP en cian, a2-d2). En la figura S1 se puede encontrar una imagen dividida que muestra cada canal de fluorescencia individualmente. e –l Estudios de topología Split-10 + 1 GFP mediante transformación transitoria mediada por Agrobacterium de hojas de N. benthamiana con GFP11-MOT2 (e, g, i y k) y MOT2-GFP11 (f, h, j y l). Cotransformación después de 2 días con GFP-10 citosólica (e1-l1) o SP-GFP1-10 apoplástica (e2-l2). Las imágenes son una combinación de los canales de detección de GFP (verde) y de autofluorescencia del cloroplasto (rojo). Las imágenes se tomaron después de 2 a 3 días utilizando un objetivo de inmersión en agua C-Apochroma 40x/1,2 (a–d) o un objetivo Plan-Neofluar 10x/0,3 (e–l). Las barras de escala representan 20 μm.

Se realizaron estudios de topología para determinar la orientación de los extremos N y C utilizando un sistema de GFP dividido en células de la epidermis de la hoja de N. benthamiana22. Las proteínas MOT2 se marcaron N- (Fig. 2e1 + 2, 2g1 + 2, 2i1 + 2 y 2k1 + 2) o C-terminal (Fig. 2f1 + 2, 2h1 + 2, 2j1 + 2 y 2l1 + 2) con el 11.ª hoja β de GFP (GFP11) y se coexpresaron con una GFP1-10 citosólica o con una GFP1-10 marcada con un péptido señal apoplasto (SP-GFP1-10). Todos los miembros de la familia MOT2 etiquetados N-terminalmente con GFP11 (GFP-11-MOT2) mostraron una señal de fluorescencia después de la reconstitución del informador con el SP-GFP1-10 apoplástico (Fig. 2e2, g2, i2 y k2). También se detectó fluorescencia después de que todos los miembros de la familia MOT2 etiquetados con GFP-11 en el extremo C (MOT2-GFP11) interactuaran con GFP1-10 citosólico (Fig. 2f1, h1, j1 y l1). En consecuencia, el extremo N de todas las proteínas MOT2 está orientado hacia el apoplasto, mientras que el extremo C está orientado hacia el citosol, lo que subraya aún más su localización PM.

Para asignar un papel fisiológico a los miembros de la familia MOT2, se estudiaron sus patrones de expresión espaciales y temporales específicos de órganos. El análisis histoquímico de plantas mot2.1:gus (Fig. 3a-e) mostró señales en raíces concentradas en tejido vascular. También se detectó expresión en la epidermis y el tejido vascular de los brotes y en flores en desarrollo con fuertes señales en los ovarios. Las hojas jóvenes mostraron una expresión global reducida a la venación de la hoja principal a medida que aumentaba la edad (Fig. 3b, c), como también se cuantificó mediante ensayo fluorimétrico (Fig. 3f). Curiosamente, el ensayo fluorimétrico también reveló un aumento significativo de la expresión de mot2.1 bajo abundancia de molibdato en todos los órganos excepto en la flor. mot2.2: las plantas gus mostraron señales muy distintas en los granos de polen de flores maduras (Fig. 3g). El análisis de mot2.3:gus mostró señales en los ovarios (Fig. 3h). La disponibilidad de molibdato no tuvo influencia en los patrones de expresión de mot2.2:gus y mot2.3:gus. La expresión de mot2.2 y mot2.3 en la flor no permitió un análisis fluorimétrico.

a – e Ensayo histoquímico GUS de plantas mot2.1:gus Arabidopsis. Se representan la raíz (a), la hoja vieja (b), la hoja joven (c), la sección transversal del brote (d) y el ovario (e). f Ensayo fluorimétrico GUS de plantas mot2.1.gus. Se representa la media de 7 a 10 plantas de tres líneas independientes para ambas condiciones. Cada órgano fue analizado por triplicado técnico. Las barras de error representan la desviación estándar. Se utilizó la prueba t no pareada para probar la significancia. ns = no significativo, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. g Ensayo histoquímico de mot2.2: flor de gus. h Ensayo histoquímico de mot2.3: flor de gus. WT no muestra actividad de fondo (Fig. S3). Las imágenes 3a, b, c, e, g y h son idénticas a las imágenes respectivas en la figura complementaria S3. Las barras de escala representan 500–2000 µm como se indica para cada panel. Las plantas para el ensayo histoquímico se cultivaron hidropónicamente en condiciones de +Mo y para ensayos fluorimétricos en condiciones de +Mo y -Mo. Los datos cuantitativos en f se analizaron adicionalmente mediante ANOVA de dos vías y la prueba post hoc de Sidak para comparación múltiple (Tabla S3).

La privación de molibdato tiene un efecto sorprendente en las plantas y conduce a una actividad reducida de las Mocoenzimas, lo que resulta en un crecimiento retardado, necrosis de las hojas, enanismo y, en última instancia, la muerte23. La pérdida de MOT puede causar este fenotipo en caso de escasez de molibdato, como se demostró para los miembros de la familia MOT17. Se analizó el fenotipo de las líneas knockout (KO) de ADN T de Arabidopsis mot2 (Tabla 1) para revelar si la pérdida de miembros de la familia MOT2 afecta el crecimiento vegetativo y la homeostasis del molibdato. La interacción entre los miembros de las familias MOT1 y MOT2 en el mantenimiento de la homeostasis del molibdato se analizó caracterizando líneas KO con un mayor grado en comparación con WT y un KO único mot1.1, que codifica la raíz principal importadora de molibdato MOT1.1. en cuanto a su impacto sobre el crecimiento vegetativo. Una pérdida del exportador vacuolar MOT1.2 no mostró efectos ni sobre el fenotipo macroscópico ni molecular como se observó en un estudio reciente7. Debido a los patrones de expresión específicos de órganos de mot2.2 y mot2.3 (Fig. 3g, h; Fig. S3), ambos fueron excluidos de los análisis de KO de mayor grado.

Curiosamente, no se observaron alteraciones notables en la supervivencia, el desarrollo (Fig. S4) o el comportamiento de crecimiento de las plantas (Fig. 4a-c). Como MOT2.1 está presente principalmente en el tejido vascular de la raíz (Fig. 3a), se realizó un ensayo de absorción de molibdato para probar si la absorción está alterada en las plantas de mot2.1-KO (Fig. 4d). Mientras que la tasa de absorción de molibdato del control positivo mot1.1-KO disminuyó significativamente en comparación con WT, mot2.1-KO mostró solo una reducción menor. La actividad de NR está directamente relacionada con la disponibilidad de Moco y, por lo tanto, es un indicador importante para mostrar la funcionalidad del suministro de molibdato. La privación de molibdato redujo significativamente la actividad de NR en el WT (Fig. 4e) de 0,47 nmol ∙ (h ∙ mgFW) −1 en un 32% a 0,32 nmol ∙ (h ∙ mgFW) −1. Se observaron resultados comparables para mot2.2-KO y mot2.3-KO. Curiosamente, mot2.1-KO mostró una reducción significativa de la actividad de NR en un 30 % tanto en condiciones de disponibilidad como de privación de molibdato.

Arabidopsis mot2-KO se cultivaron bajo disponibilidad de molibdato (+/+Mo) y privación (–/–Mo) en un sistema hidropónico durante 85 días. a Peso fresco de hojas en roseta. b Longitud de la raíz. c Curva de crecimiento del área foliar en 85 días. Se representa la media de 8 a 15 individuos. d Tasa de absorción de molibdato normalizada al área foliar de WT, mot1.1-KO y mot2.1-KO de plantas de 56 días. Se representa la media de 6 a 9 individuos para los controles y 26 individuos de mot2.1-KO. Los datos cuantitativos se analizaron adicionalmente mediante ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Dunnet para comparación múltiple (Tabla S4). e Actividad NR de mot2-KO cultivados hidropónicamente durante 60 días. Se representa la media de 8 a 15 individuos. Las barras de error representan la desviación estándar. Se utilizó la prueba T no apareada para las pruebas de significancia. ns = no significativo, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Los datos cuantitativos se analizaron adicionalmente mediante ANOVA bidireccional y prueba post hoc de Tukey para comparación múltiple (Tabla S5).

El mot1.1 mot2.1 doble KO (dKO) y un mot1.1 mot1.2 mot2.1 triple KO (tKO) mostraron solo ligeras alteraciones cuando se cultivaron hidropónicamente bajo privación de molibdato en el peso fresco, la producción de área foliar y la longitud de las raíces (Fig. .S5a–c) en comparación con la disponibilidad de molibdato. En las mismas condiciones, el mot1.1 mostró una reducción significativa de la producción de área foliar como se observó recientemente7. Curiosamente, a mot1.1 mot1.2 mot2.1 tKO mostró una supervivencia de la planta que se redujo significativamente en un 45 % en comparación con las condiciones de control (Fig. S5d). La reducción significativa observada en la actividad de NR en mot1.1 mot2.1 dKO (Fig. S5e) fue comparable a la de mot1.1 KO bajo privación de molibdato como ya se describió anteriormente7. Curiosamente, mot1.1 mot1.2 mot2.1 tKO mostró una actividad de NR drásticamente reducida incluso en condiciones de disponibilidad de molibdato que disminuyó aún más significativamente bajo privación de molibdato.

Las proteínas citosólicas de Moco-biosíntesis experimentan estrechas interacciones proteína-proteína en un complejo multiproteico anclado a la actina por Cnx124. Además, Cnx1 recibe molibdato de la vacuola mediante la interacción con MOT1.27. Por lo tanto, se investigó un suministro directo de Cnx1 con molibdato extracelular mediante la interacción proteína-proteína con la familia MOT2 mediante complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC).

Aquí, solo se tuvo en cuenta una fusión del indicador C-terminal con miembros de la familia MOT2, ya que los estudios de topología revelaron que solo el extremo C está orientado hacia el citosol. La acuaporina AtPIP2A está localizada en PM20 y sirvió como control negativo. MOT2.1-VYNE coexpresado con Cnx1-SCYCE mostró una intensidad de fluorescencia más brillante (Fig. 5a1) que el control negativo (Fig. 5a2). Los controles de abundancia (Fig. S6) mostraron intensidades de fluorescencia comparables, lo que indica que MOT2.1 y AtPIP2A estaban presentes en cantidades iguales. Los resultados demuestran la interacción de MOT2.1 con Cnx1. El análisis de MOT2.1 y Cnx1 mediante experimentos de luciferasa dividida (LUC dividida) subraya esta interacción y designa el dominio G de Cnx1 como principal socio de interacción (Fig. S7). Los enfoques de interacción BiFC de MOT2.2A (Fig. 5b1) y MOT2.3 (Fig. 5d1) mostraron intensidades de fluorescencia más altas en comparación con los respectivos controles negativos que demuestran interacciones con Cnx1 (Fig. 5b2, d2). Sólo el MOT2.2B más corto no mostró interacción con Cnx1 (compárese con las figuras 5c1, c2).

a1 – d1 Enfoques de interacción con hojas transformadas transitoriamente de N. benthamiana que coexpresan MOT2-VYNE y Cnx1-SCYCE. a2 – d2 Controles negativos con AtPIP2A-VYNE. Las imágenes representan la capa de células de la epidermis de la hoja inferior y se tomaron con un Plan-Neofluar 10x/0,3. Las barras de escala representan 20 μm. Los controles de abundancia, donde CLuc reemplaza a Cnx1, mostraron intensidades de fluorescencia comparables de las proteínas de interés y el control negativo para mostrar artefactos derivados de la interacción aleatoria (Fig. S6).

Hasta ahora no estaba claro cómo se importa el molibdato a la vacuola. Dado que ningún miembro de la familia MOT2 estaba localizado en el tonoplasto, se sugiere un mecanismo independiente. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de la formación de complejos de glutatión (GSH) y el ion molibdato de metal pesado (HM). En general, los HM (p. ej., cadmio) son secuestrados de forma no específica por el GSH, canalizados hacia la vacuola y liberados25.

La formación de complejos de GSH con iones de cadmio induce la transferencia de carga de grupos sulfhidrilo que muestran absorción en la región espectral del ultravioleta lejano (UV)26. Para estudiar si tal efecto podría explicar el secuestro de molibdato, se incubaron y analizaron mediante espectroscopia concentraciones equimolares de GSH y molibdato (Fig. 6a). Después de restar el fondo de molibdato, se observó un cambio de batocromo de λmax = 221 nm a λmax = 261 nm y un aumento de la intensidad máxima cuando ambos componentes se mezclaron, dando una primera indicación de complejos GSH-molibdato.

un espectro UV de GSH y GSH con molibdato. b Espectros HRMS de GSH, molibdato y una mezcla de GSH-molibdato registrados en modo negativo. Se muestran intensidades absolutas de iones en el rango de m/z = 420–445. No hay iones dominantes presentes en la muestra de GSH. Los iones no asignados en el molibdato MS posiblemente provienen de polimolibdatos. La solución que contiene molibdato y GSH muestra nuevos iones que no están presentes en las soluciones madre que contienen únicamente GSH o molibdato. Comparación con el patrón isotópico calculado de una fórmula de suma compleja de GSH-molibdato C10H14MoN3O8S-. c Fragmentación MS2 de C10H14MoN3O8S- con 25 energía de colisión normalizada. Las masas de fragmentos observadas experimentalmente coincidieron con las calculadas (Panel d). d Fragmentación propuesta de un complejo de quelato de molibdato con GSH bidentado, que coincide con los iones observados en los experimentos de MS2 (Panel c). Se enumeran masas exactas y las respectivas fórmulas de suma.

La presencia de complejos GSH-molibdato se verificó mediante espectrometría de masas de alta resolución (HRMS). Las soluciones mixtas de GSH y molibdato muestran un ion que no está presente en soluciones puras de ambos componentes. Al nuevo ion ([M-H+] = 433,9561) se le asignó la fórmula molecular C10H14MoN3O8S- (Fig. 6b), lo que indica la formación de un complejo quelato con GSH bidentado y molibdato bajo la eliminación de agua. Este complejo se formó de manera reproducible bajo diferentes proporciones molares de GSH y molibdato (1:1 a 9:1) y varios valores de pH (pH = 3–9). El patrón isotópico observado concuerda con la relación isotópica calculada para un complejo GSH-molibdato (Fig. 6b). El carácter ambidentado del GSH permite varios tipos de complejación con molibdato. Así, el ion correspondiente (m/z = 433,9561) se analizó mediante espectrometría de masas en tándem (MS2) a diferentes energías de colisión para descifrar su estructura (Fig. 6c). El uso de (98MoO42-) enriquecido isotópicamente simplificó los espectros de MS2, que mostraron la pérdida de un fragmento consistente con C5H7NO3. Este fragmento fue asignado como glutamina (Fig. 6d), lo que indica que el molibdato forma complejos con glicina y cisteína. En consecuencia, un fragmento correspondiente a HMoO3S- apoyó la complejación de cisteína con azufre (Fig. 6c, d). Estos experimentos HRMS sugieren que el GSH actúa como ligando bidentado, quelando el molibdato a través del carboxilato de glicina y el tiol en la cisteína.

El molibdato es un micronutriente crucial para las plantas y actúa como componente activo de Moco, del que depende la actividad de importantes enzimas Moco. La absorción de molibdato se mantiene mediante proteínas MOT especializadas. Mientras que la fisiología de la familia MOT1 en Arabidopsis se comprende bien7, la homeostasis global del molibdato no estaba clara hasta ahora. La presencia de una familia MOT2 en A. thaliana se postuló repetidamente; sin embargo, su función MOT nunca se ha demostrado experimentalmente hasta ahora. Mediante estudios in silico, se identificaron tres genes mot2 que codifican cuatro proteínas MOT2 con alta similitud de secuencia con el CrMOT2 caracterizado8,9. Todas las proteínas codificadas comparten cuatro motivos altamente conservados esenciales para el transporte de molibdato8. Los cuatro candidatos a MOT importaron molibdato en células de levadura con menor capacidad que MOT1.1, que se ha caracterizado como importador de alta afinidad10. Además, todos los MOT2 están localizados en el PM. Por lo tanto, los miembros de la familia MOT2 generalmente mantienen la importación de molibdato desde el espacio extracelular al citosol. Sin embargo, su patrón de expresión específico de órgano individual sugiere funciones fisiológicas versátiles, que complementan a la familia MOT1.

Recientemente se demostró que la pérdida del principal importador de molibdato radicular, MOT1.1, provocó enanismo y redujo drásticamente la actividad de NR en condiciones de escasez de molibdato causada por una reducción de la absorción de molibdato7. La expresión observada de mot2.1 en las raíces podría indicar un papel de apoyo en la absorción de molibdato. Sin embargo, la pérdida de MOT2.1 no tiene impacto en la absorción de molibdato del suelo, lo que apunta a una función diferente después de que MOT1.1 haya absorbido molibdato. MOT2.1 podría más bien ser responsable de la distribución de molibdato dentro de la planta, así como de la entrega de molibdato a la biosíntesis de Moco. Este modelo está respaldado por una fuerte expresión de mot2.1 en tejido de hojas jóvenes, tejido vascular de brotes y venación de hojas principales que es inducida por la presencia de molibdato, por su localización PM y por su interacción proteica directa con la insertasa de molibdeno Cnx1. La pérdida de MOT2.1 afectó la eficiencia de la biosíntesis de Moco debido al suministro reducido de molibdato, observado por la reducción de la actividad de NR. Por el contrario, la falta de MOT2.2 A, MOT2.2B y MOT2.3 no tuvo efecto sobre el crecimiento vegetativo ni sobre la actividad de NR. Esto lleva a la conclusión de que, aunque se detectó una interacción de MOT2.2 A y MOT2.3 con Cnx1, solo desempeñan papeles menores en el suministro de la biosíntesis de Moco.

Sorprendentemente, todos los miembros de la familia MOT2 se expresan en la flor. Ambos, mot2.1 y mot2.3, se expresan altamente en los ovarios, donde tiene lugar la importación de nutrientes esenciales a las semillas en desarrollo. Teniendo en cuenta su expresión específica de órganos, se puede suponer que intervienen en la carga de molibdato en las semillas en desarrollo.

Además de hacer que el molibdato esté disponible para la generación hija, altas cantidades de molibdato en las semillas en desarrollo podrían cumplir dos funciones adicionales. En primer lugar, la Mocoenzima AAO cataliza el último paso de la biosíntesis de ABA, que es la hormona clave para promover la latencia de las semillas5. Aunque la mayor parte del ABA se origina en el tejido vegetativo y se transporta a la semilla, el ABA también se produce en los tejidos que recubren las semillas27. Esta demanda de molibdato para Moco funcional puede satisfacerse mediante la actividad MOT. En segundo lugar, podrían ser necesarias altas concentraciones de molibdato (>250 µM) en los órganos reproductivos con respecto a su efecto inhibidor sobre las fosfatasas del ácido púrpura (PAP)28. La principal forma de almacenamiento de fósforo en las semillas y los granos de polen es el ácido fítico. Un miembro de las PAP, AtPAP15, está localizado en los granos de polen y se cree que es la fitasa clave durante la germinación del polen para movilizar las reservas de fósforo28. Un análisis de todo el genoma de los genes pap en Brassica rapa reveló funciones potenciales de varios PAP en la maduración, germinación y elongación del tubo polínico29. Por lo tanto, se puede suponer que el molibdato actúa como inhibidor clave de las PAP para evitar la maduración y germinación prematuras del polen. La expresión de mot2.2 en los granos de polen sugiere su participación en este importante proceso.

El esclarecimiento de las funciones fisiológicas de la familia MOT2 brinda una visión amplia de la homeostasis del molibdato. El importador radicular MOT1.1 absorbe molibdato del suelo con una afinidad sorprendentemente alta7,10. En plantas más jóvenes, MOT2.1 participa en la distribución en toda la planta, la importación celular y el suministro de Moco-biosíntesis con molibdato a través de la interacción directa con Cnx1. Estudios anteriores revelaron que la vacuola sirve como almacenamiento principal12 desde donde MOT1.2 exporta molibdato y lo entrega a Cnx1 para la mocobiosíntesis7. Curiosamente, una perturbación de esta interacción tiene un efecto severo sobre el crecimiento vegetativo. La pérdida simultánea del principal importador radicular MOT1.1, el principal importador celular MOT2.1 y el exportador de tonoplastos MOT1.2 mostró una reducción drástica en la actividad de NR que culminó en una tasa de supervivencia de la planta fuertemente reducida independientemente de la presencia de molibdato.

Dado que el molibdato libre como ion HM tiene un potencial peligroso25, la ruta del molibdato a través de la planta plantea una pregunta interesante: ¿Cómo se importa el molibdato a la vacuola después de la importación celular? Un mecanismo general de afrontamiento es la conjugación de iones HM con GSH mediada por GSH-S-Transferasas30. El conjugado se importa a la vacuola y se disocia debido a los cambios de pH25. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el GSH secuestra el exceso de molibdato para evitar procesos tóxicos. Este modelo fue respaldado por un cambio de batocromo en la absorción causado por la formación de complejos de GSH/molibdato, como se muestra para varios complejos de HM/GSH26,31 y, además, se evidencia mediante experimentos de espectrometría de masas. Estos resultados respaldan un modelo en el que el molibdato se canaliza en conjugación con GSH hacia la vacuola mediante transportadores HM/GSH inespecíficos32. Allí, el complejo se disocia debido al cambio de pH, de modo que MOT1.2 puede almacenar y exportar molibdato cuando sea necesario para la biosíntesis de Moco. Todos los miembros de la familia MOT2 se expresan en los órganos reproductivos para importar molibdato. Por lo tanto, ambas variantes de empalme de MOT2.2 podrían cumplir diferentes funciones: mientras que MOT2.2 A interactúa directamente con la Moco-biosíntesis para suministrar AAO, MOT2.2B no interactúa con la Moco-biosíntesis y podría suministrar molibdato libre para la inhibición de la PAP y la semilla. almacenamiento de nutrientes.

Recientemente, las proteínas de la familia MOT2 fueron implicadas como transportadores SAM ubicados en el Golgi14. En este estudio, el doble KO de mot2.1 (GoSAMT2) y mot2.2 (GoSAMT1) mostró una reducción de la metilación de polisacáridos sintetizados por Golgi y un cambio en la arquitectura de la pared celular. Además, las señales de fluorescencia de MOT2-GFP se ubicaron conjuntamente con el marcador de Golgi GmMan-1 etiquetado con GFP. Los resultados del presente estudio confirmaron la localización en Golgi de todas las proteínas de la familia MOT2, pero también mostraron su clara localización de PM y, lo más importante, su actividad de transporte de molibdato. Dada su diferente localización y diferentes sustratos, se puede asumir que la familia MOT2 tiene un carácter de pluriempleo al cumplir más de una sola función33. Es probable que haya actividad de las proteínas de la familia MOT2 en Golgi y PM, ya que el Golgi es una estación de miembros de la familia MOT2 en camino a su destino final, el PM34. También para otros miembros del Moco-metabolismo se demostró actividad de pluriempleo35. Por ejemplo, la gefirina, el homólogo humano de Cnx1, participa en la interacción transportador neuronal/microtúbulos36, mientras que las proteínas de unión a Moco también participan en la biosíntesis de citoquininas37. Por lo tanto, los transportadores pluriempleados de la familia MOT2 son de vital importancia para la importación de SAM al Golgi y la homeostasis del molibdato en toda la planta.

Se probaron en levadura las actividades de transporte de molibdato de los candidatos a MOT2. Como la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae ha perdido el metabolismo del molibdeno durante la evolución y, por lo tanto, no alberga mocoenzimas16, es un organismo modelo adecuado para probar el transporte de molibdato, como se describe en detalle en la Tabla S1.

Se utilizaron plantas WT de N. benthamiana para localización, topología y análisis BiFC. Se utilizó el ecotipo WT A. thaliana Col-0 para generar líneas transgénicas estables que portaban construcciones endógenas mot2:gfp-gus y como plantas de control. Las líneas KO de inserción de ADN T de A. thaliana (Tabla 1) se mantuvieron de NASC (Nottingham, Reino Unido). La presencia de inserción de ADN-T en los loci correctos y el estado homocigótico de las líneas KO utilizadas se verificaron mediante PCR de genotipado. Los KO de mayor grado se generaron cruzando manualmente líneas de KO individuales. No se pudo validar el estado de disponibilidad de molibdato entre líneas compradas a NASC y el generado por cruce manual.

Atmot2.1 fue identificado según Tejada-Jiménez8 utilizando TAIR38. El análisis de mot2.1 con EnsmblPlants39 reveló dos parálogos altamente relacionados en A. thaliana (AT1G64650 y AT3G49310). Se realizó una alineación ClustalW de la familia MOT2 utilizando MEGA1140 para analizar la similitud de secuencia. La alineación se visualizó utilizando el software BioEdit41. La secuencia de mot2.2b se excluyó de este análisis debido a su alineación completa con mot2.2a.

La actividad de transporte de molibdato de los candidatos a MOT2 se investigó mediante un ensayo de crecimiento in vivo utilizando cepas transgénicas de levadura Moco (Tabla S1). El medio de crecimiento con pH 5,8 consistía en un medio a base de nitrógeno y levadura (6,7 g/l; Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) complementado con una solución de eliminación 10x (200 mg/l de arginina, 300 mg/l de isoleucina, 300 mg/l de lisina, 200 mg/L de metionina, 500 mg/L de fenilalanina, 2000 mg/L de treonina, 300 mg/L de tirosina, 1500 mg/L de valina, 100 mg/L de hemisulfato de L-adenina, 200 mg/L de histidina, 1000 mg/L leucina, 400 mg/l de triptófano) diluido a una concentración 1x y 0,2 % (p/v) de fructosa (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos). Después de agitar a 200 rpm durante 48 h a 30 °C, se agregaron 10 ml de precultivo inoculado con una cepa de levadura Moco a 190 ml de medio de crecimiento para el cultivo principal y se incubaron de manera análoga. Posteriormente, la suspensión de levadura se llenó en tubos de 50 ml y se centrifugó durante 15 minutos a 5200 x g. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se dividió en tubos de reacción de 1 ml, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 5200 x g. Después de eliminar el sobrenadante, el sedimento se congeló en nitrógeno líquido. Se añadió galactosa (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos) a una concentración final del 2 % (p/v) a un medio de crecimiento que contenía clorato de sodio 250 mM (NaClO3; Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) y molibdato de sodio 100 nM (Na2MoO4; Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.) para la inducción de la expresión del gen mot. Para condiciones de no inducción, se añadió en su lugar el mismo volumen de agua. Se inoculó medio de crecimiento hasta una DO600 de 0,1 con cepas de levadura Moco transgénicas. Un enfoque de control no contenía clorato de sodio. Se cargó una placa de flores MTP de 48 pocillos (m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Alemania) con 1 ml de suspensión celular por pocillo por duplicado y se selló con una lámina semipermeable (F-GPR48-10, m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Alemania) para permitir el intercambio de gases. La placa de flores se cargó en un BioLector® I (m2p labs Beckman Coulter, Aachen, Alemania) permitiendo la incubación de la placa agitando a 1200 rpm durante 7 días a 30 °C y mientras se monitoreaba simultáneamente el aumento de biomasa. Por lo tanto, la dispersión de la luz a 620 nm se detectó como unidad relativa de luz (RLU) como índice de biomasa. Se seleccionó un umbral de biomasa de 40 RLU para permitir la comparación de diferentes cepas y analizar más a fondo el comportamiento de crecimiento. En los enfoques de control se demostró que la influencia de los componentes únicos del ensayo de crecimiento (clorato de sodio, molibdato de sodio y combinaciones de azúcar) sobre el comportamiento de crecimiento de cada cepa de levadura Moco era insignificante.

Las secuencias codificantes (CDS) de los genes mot2.1 (AT4G27720), mot2.2a (AT1G64650.1), mot2.2b (AT1G64650.2) y mot2.3 (AT3G49310) de A. thaliana fueron amplificadas mediante polimerasa Phusion (Thermo Scientific , Waltham, MA, EE. UU.) a partir de ADNc de A. thaliana con cebadores flanqueados por el sitio attB para utilizar el sistema de clonación GATEWAY (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.). Los fragmentos de PCR se insertaron en el vector pDONR/Zeo mediante reacción de BP generando vectores de entrada pEntry-mot2.

Para los estudios de localización, los vectores de entrada resultantes se recombinaron con vectores pDest-GW-venus usando la reacción LR para generar vectores de expresión que codifican construcciones de fusión mot2-venus. Como marcador citosólico se utilizó eqFP61142. Para crear un marcador PM, el CDS de Atpip2a (AT3G53420) de A. thaliana se amplificó con cebadores flanqueados por el sitio attB y se subclonó mediante reacción BP en el vector pDONR/Zeo. La recombinación con pDest-GW-rfp43 mediante reacción LR condujo al vector de expresión pExp-Atpip2a-rfp. El marcador de Golgi man1 de soja (Glycine max) se sintetizó a partir de dos oligonucleótidos que fueron hibridados y amplificados en una primera PCR. Una segunda PCR con cebadores flanqueados por el sitio attB permitió utilizar el fragmento en una reacción de BP para crear un vector de entrada. Una reacción de LR con pDest-GW-rfp generó el vector de expresión pExp-GmMan-1-RFP.

Los estudios de topología de la familia MOT2 se llevaron a cabo utilizando el sistema GFP Split-10 + 1 basado en GATEWAY22. Los vectores fueron amablemente proporcionados por el Prof. Thordal-Christensen de la Universidad de Copenhague. La reacción LR de los vectores pEntry-mot2 y los vectores de expresión pDest-GW-gfp11 y pDest-gfp-GW se generaron codificando construcciones con GFP11 fusionado al extremo N o C de MOT2. El fragmento GFP1-10 se coexpresó con localización citosólica (GFP1-10) o con localización en el apoplasto mediante el uso del péptido señal de AtWAK2 (A. thaliana Wall Associated-Kinase 2, AT1G21270), lo que dio como resultado SP-GFP1-1044. .

Para los ensayos BiFC, los vectores de entrada con CDS de mot2 y Atpip2a se recombinaron mediante reacción LR con el vector de destino pDest-GW-vyne, lo que dio como resultado vectores de expresión que codifican las construcciones mot2-vyne y Atpip2a-vyne. La mitad C-terminal de la luciferasa citosólica (CLuc)24 se utilizó como control de abundancia. El CDS se amplificó mediante PCR Phusion con cebadores flanqueados por el sitio attB y se utilizó en una reacción de BP para generar vectores de entrada. Estos se usaron en la reacción de LR con pDest-GW-vyne y pDest-GW-scyce para generar vectores de expresión pExp-Atpip2a-vyne y pExp-nsp3-scyce. La generación de vectores de expresión pExp-cnx1-scyce se generó mediante reacción LR con el vector de destino pDest-GW-scyce y el vector de entrada pEntry-cnx1 (AT5G20990)43.

Para los análisis de split-Luc, la reacción LR utiliza los vectores de expresión pExp-mot2.1-clu generados por pEntry-mot2.1 y pDest-GW-cluc. Los vectores de expresión pExp-cnx1-nluc, pExp-cnx1e-nluc, pExp-cnx1g-nluc, los controles negativos pExp-nsp3-nluc y el control de abundancia pExp-scyce-nluc se generaron mediante clonación mediante reacción LR de los vectores de entrada pEntry-cnx1 (AT5G20990 ), pEntry-nsp3 (AT3G16390) y el extremo BiFC pEntry-scyce en el vector de destino pDest-GW-nluc45. El vector de expresión pExp-Atpip2a-cluc se generó mediante reacción LR con pEntry-Atpip2a y pDest-GW-cluc. Los cebadores utilizados para generar los vectores (Tabla S6) de este estudio se enumeran en la Tabla S7. La transformación de la planta para localización, topología, BiFC y ensayo split-Luc se llevó a cabo según Minner-Meinen et al.7. La expresión en hojas de N. benthamiana se llevó a cabo mediante transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens45,46,47. La preparación de protoplastos y la transformación química se llevaron a cabo según Negrutiu et al.48. Las plántulas de A. thaliana se transformaron mediante el método FAST (transformación rápida de plántulas mediada por agro)49.

La germinación de N. benthamiana se logró en tierra para macetas común a 22–25 °C con 10 h de luz artificial (≈ 60 µE) por día en condiciones de invernadero y suficiente suministro de agua. Las plántulas se transfirieron dos semanas después de la germinación a macetas de 9 × 9 cm que contenían tierra para macetas mezclada con un 1% de fertilizante NPK (Blaukorn® classic, Compo Expert, Münster, Alemania) y un 5% de perlita. Para los experimentos se utilizaron plantas de cinco a 12 semanas de edad. Las semillas de A. thaliana se estratificaron a 4 ° C durante 48 a 72 h. Dos semanas después de la germinación en tierra de maceta común, las plántulas se transfirieron a macetas de 5 × 5 cm y se cultivaron a 22–25 °C en una fitocámara transitable con 10 h de luz artificial (≈ 60 µE) por día y 60– 70% de humedad.

Las plantas se cultivaron en un sistema de crecimiento hidropónico50 modificado según Minner-Meinen et al.7. La germinación y la solución nutritiva basal (¼ de solución de Hoagland) con un valor de pH de 5,6 se prepararon con 100 nM de molibdato de sodio (+ Mo, disponibilidad de molibdato) o excluyendo el molibdato de sodio de la receta original (-Mo, privación de molibdato). . Se sembraron semillas de A. thaliana en tapas de tubos de microcentrífuga con un orificio y se colocaron en un tanque de germinación. Después de 20 días, las plantas se transfirieron a tanques aireados y se cosecharon después de un lapso total de 60 días. Desde los tanques de germinación también se transfirieron las plántulas a tubos de centrífuga de 130 ml y se cultivaron en condiciones de disponibilidad de molibdato para el ensayo de absorción de molibdato.

Se eliminaron los pétalos y el estambre de una flor de la planta madre que llevaba una inserción de ADN-T KO para evitar la autofertilización del ovario. Se utilizó estambre que albergaba polen maduro de una planta madre que llevaba una segunda inserción de ADN-T KO para fertilizar el ovario preparado de la planta madre. El ovario fertilizado se llevó a la maduración de la semilla. Las semillas cosechadas se cultivaron bajo selección de antibióticos y la presencia de la inserción de ADN T heredada se probó mediante PCR de genotipado.

Los promotores endógenos se definieron como la región de 1998 pb (mot2.1), 1924 pb (mot2.2) y 1980 pb (mot2.3) aguas arriba de cada codón de inicio. Las regiones se amplificaron a partir de ADN genómico de A. thaliana mediante PCR phusion con cebadores flanqueados por el sitio attB. Los fragmentos se subclonaron utilizando el sistema de clonación GATEWAY (Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU.) en pDONR/Zeo mediante la reacción de BP que genera vectores de entrada. Mediante recombinación mediante reacción LR con vectores de expresión pKGWFS751 que codifican una construcción de fusión GFP-GUS expresada bajo el control de los promotores mot2 endógenos (mot2.1:gus, mot2.2:gus y mot2.3:gus). Para generar líneas estables de A. thaliana se realizó inmersión floral52 con Agrobacterium tumefaciens. La selección de transformantes en la generación T0 y T1 se llevó a cabo con kanamicina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos). Para evitar efectos posicionales de la integración aleatoria del ADN-T después de la transformación de Agrobacterium, se utilizaron tres líneas generadas individualmente para experimentos adicionales. La presencia de las construcciones mot2.gus se analizó mediante PCR utilizando ADN genómico.

Los ensayos GUS histoquímicos y fluorimétricos son muy adecuados para recopilar información tanto cualitativa como cuantitativa sobre la expresión génica específica de órganos de los miembros de la familia mot2. Los ensayos se llevaron a cabo según Minner-Meinen et al.7. Se cultivaron líneas transgénicas de A. thaliana mot2:gus hidropónicamente bajo disponibilidad de molibdato para tinción histoquímica. El material vegetal se incubó con solución de tinción GUS53 a través de una cámara de vacío y se incubó a 37 °C durante la noche. Después de la extracción de clorofila con etanol al 70% (v/v), la documentación se llevó a cabo utilizando un microscopio digital Keyence VHX (Keyence, Osaka, Japón). Las plantas WT utilizadas como control no mostraron ninguna señal de fondo en los órganos analizados (Fig. S3).

El ensayo fluorimétrico se realizó con plantas mot2.1:gus cultivadas hidropónicamente bajo disponibilidad y privación de molibdato. El material vegetal se separó en raíces, hojas jóvenes, hojas viejas, brotes y flores durante la cosecha y la extracción de proteínas se realizó por triplicado. Las muestras se cargaron en una placa de 96 pocillos y se mezclaron con una solución de reacción de GUS que contenía metilumbeliferilglucurón (MUG; Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Bajos) que puede escindirse mediante GUS en el producto fluorescente MU (metilumbeliferil; excitación: 365 nm, emisión: 455 nm). ). La fluorescencia se midió utilizando un lector multimodo Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) durante un lapso de 40 minutos. La actividad de GUS se calculó como la tasa de ganancia en la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo normalizada a la cantidad de proteína total medida mediante el ensayo de Bradford utilizando el reactivo Roti®Quant (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania). Se utilizaron plantas WT como control negativo y no mostraron señal de fluorescencia en los órganos analizados.

El área foliar de plantas de A. thaliana que crecen hidropónicamente se midió utilizando el software Easy Leaf Area54. Se utilizó como referencia un cuadrado rojo con un área de 4 cm2. Al establecer el número de píxeles verdes en relación con el número conocido de píxeles rojos, se determinó el área de la hoja de forma rápida y no invasiva. Durante 60 días, se tomaron fotografías por triplicado con una Panasonic Lumix DMC-GX80 y una lente de cámara Panasonic H-FS 1442 A (Panasonic, Kadoma, Japón) cada 2 días. Además, se registraron las etapas de desarrollo de las plantas55 cada 2 días y se analizó la supervivencia general de las plantas. Después de 60 días se cosecharon las plantas y se midieron el peso fresco y la longitud de las raíces.

A. thaliana (8 semanas de edad) se cultivó en tubos de 130 ml llenos de molibdato que contenía una solución nutritiva básica. Después de dos semanas, se recogió el medio en duplicados de 50 ml y se determinó el área foliar. Las concentraciones de molibdato se midieron de forma modificada según Cárdenas y Mortensen56. Un volumen de muestra de 50 ml redujo el límite de detección del ensayo a 10 nM de molibdato. Las muestras se mezclaron completamente con 50 µl de ácido sulfúrico y 250 µl de reactivo de ensayo (hidróxido de sodio al 2 % (p/v), 2 g/l de 1,2-dimercapto-4-metilbenceno, Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.; 16 ml/l de ácido tioglicólico, Supelco, Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.) durante 1 min y se agitó durante 20 min. Después de agregar 1 ml de acetato de isoamilo puro, mezclar durante 2 min y agitar durante otros 20 min, se extrajo la fase orgánica del extremo cónico del tubo. La extinción se midió en una cubeta resistente a disolventes a 680 nm en blanco frente a disolvente puro. Se midió una curva de calibración de 0 a 150 nM de molibdato de sodio habilitado en una solución nutritiva básica para determinar la concentración de molibdato. La cantidad de molibdato absorbido se calculó y normalizó con el área foliar. Las plantas WT y las plantas mot1.1-KO sirvieron como control positivo y negativo, respectivamente.

El ensayo de actividad enzimática NR57 se llevó a cabo según Minner-Meinen et al.7. El material foliar de las líneas mot2-KO cultivadas hidropónicamente bajo disponibilidad y privación de molibdato se recogió y homogeneizó bajo enfriamiento con nitrógeno líquido. El homogeneizado se mezcló con tampón de extracción, se mezcló bien y se centrifugó. La reacción del ensayo se inició mezclando el extracto con tampón de ensayo y se detuvo después de 10 min, 20 min y 30 min añadiendo acetato de zinc. La cantidad de nitrito formado se midió colorimétricamente después de la reacción con sulfanamida (SA; Merck, Darmstadt, Alemania) y cloruro de N-[naftil-(1)]-etilendiamonio (NED; Sigma Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.). La actividad de la enzima NR se calculó en nmol NO2- por mg de peso fresco y hora.

Se prepararon soluciones madre de GSH reducido (Duchefa, Harlem, Países Bajos) y molibdato de sodio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EE. UU.) en agua con una concentración de 2 mM. La muestra de GSH 2 mM se diluyó con agua hasta una concentración de 1 mM. El espectro de cada muestra se registró midiendo la extinción de la luz en la región UV que oscila entre 190 nm y 350 nm en cubetas UV especiales con un espesor de capa de 1 cm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 2100 pro UV/VIS (Amersham Biosciences, Amersham, REINO UNIDO). Posteriormente, se restó del espectro mediante blanco el fondo de una solución de molibdato de sodio con una concentración de 1 mM. La solución de GSH y molibdato se mezcló equimolarmente a una concentración de 1 mM cada uno y se registró el espectro de extinción.

Las mediciones de espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS) se realizaron utilizando Q Exactive Orbitrap (espectrómetro de masas Orbitrap cuadrupolo de sobremesa de alto rendimiento; Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania) HRMS con fuente de iones por electropulverización (rango de masas en modo negativo: m/z = 100–1500) y el sistema UHPLC Ultimate3000 (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Las muestras se inyectaron mediante inyección directa (el caudal fue de 0,6 ml·min-1) o mediante UHPLC. Se utilizaron las siguientes condiciones de UHPLC: Se utilizó una columna Accucore C18 (2,1 x 100 mm, 2,6 μm, Thermo Fisher, Bremen, Alemania) con elución en gradiente de la siguiente manera: MeCN (0,1% (v/v) HCOOH)/H2O (0,1 % (v/v) HCOOH) inicialmente a 5:95, alcanzando 2:98 durante 7 min, luego manteniendo 2:98 durante 3 min. El caudal fue de 0,2 ml·min-1 y el volumen de inyección fue de 3 µl. El molibdeno enriquecido isotópicamente (enriquecimiento >98%) se adquirió de Eurisotop (Saint-Aubin Cedex, Francia). El óxido de molibdeno 98MoO3 se disolvió en una solución de hidróxido de sodio para mantener una solución de molibdato de sodio. Posteriormente, la solución de isótopos preparada se diluyó con agua desionizada para mantener una solución madre que contenía 10-2 mol L-1 de molibdato.

Se prepararon tres soluciones madre separadas (1 ml cada una) con Na2MoO4, Na298MoO4 y GSH a una concentración de 10-2 mol·L-1 en agua. La solución madre de GSH (100 μl) se diluyó con agua (900 μl) antes de la medición de MS. Se mezclaron una solución madre de Na2MoO4 (100 μL, 1 eq.) y una solución madre de GSH (100 μL, 1 eq.) y se almacenaron a temperatura ambiente (~22 °C) durante 1 h. Antes de la medición de MS, la solución se diluyó con agua (1800 μL). La solución madre de Na2MoO4 (100 µl) se diluyó con agua (900 µl) antes de la medición de EM. Todas las muestras se midieron con HRMS mediante inyección directa. Posteriormente, se prepararon soluciones que contenían molibdato y GSH con relaciones molares de 1:1 a 1:9. Tras la medición de MS, se mantuvieron resultados idénticos, es decir, se detectó m/z = 433,9556 en todas las muestras. Además, los valores de pH de las soluciones se establecieron en 3, 5, 6, 7 y 9 y se midieron mediante HRMS. En todos los casos se observó el mismo ion con m/z = 433,9556.

La interacción proteína-proteína se analizó mediante un ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular43,47 según Minner-Meinen et al.7. Para permitir resultados comparables, se analizó la epidermis inferior de 5 a 10 discos de hojas de 2 a 3 plantas de N. benthamiana con configuraciones cLSM idénticas. El enfoque de interacción incluyó construcciones de fusión MOT2-VYNE y Cnx1-SCYCE expresadas en la mitad de una hoja. El control negativo consistió en AtPIP2A-VYNE y Cnx1-SCYCE expresados ​​en la otra mitad de la hoja. Se llevó a cabo un control de abundancia donde se intercambió Cnx1-SCYCE con la mitad C-terminal de la luciferasa citosólica (Luc) fusionada a SCYCE (CLuc-SCYCE) para permitir la estimación de diferentes niveles de concentración de la proteína de control negativo en correlación con la interacción. acercarse a la contraparte y las señales de fluorescencia aleatorias resultantes43.

Los estudios de localización, topología y BiFC se llevaron a cabo utilizando un microscopio de barrido láser confocal (cLSM) LSM 510 Meta de Zeiss (Göttingen, Alemania)7,46. El cabezal de escaneo cLSM-510META se conectó a Axiovert 200 M. Todos los objetos se analizaron con un objetivo de inmersión en agua Plan-Neofluar 10x/0,3 o C-Apocromático 40x/1,2. La excitación se llevó a cabo utilizando un láser de argón (línea de 488 nm para todos los enfoques VENUS, así como autofluorescencia de clorofila) o un láser de helio-neón (línea de 543 nm para eqFP611). La división del haz primario se logró mediante espejos UV/488/543/633. Los divisores de haz secundarios actuaron a 545 nm. Se utilizaron conjuntos de filtros para la detección de fluorescencia de la siguiente manera: BP 505-530 nm para todos los enfoques de GFP dividida (Emmax: 510-515 nm) y VENUS (Emmax: 525 nm); BP 560-615 para eqFP611 (Emmax: 611 nm); LP 650 nm para autofluorescencia de clorofila. Se utilizó el modo Lambda para examinar la firma espectral de todos los fluoróforos. Todas las imágenes se tomaron con el software de microscopio ZEISS ZEN 2009.

El ensayo Split-Luc para analizar la interacción proteína-proteína se realizó mediante imágenes de complementación de luciferasa de hojas flotantes (FLuCI) según Kaufholdt et al.45. El enfoque de interacción consistió en hojas que coexpresaban MOT2.1-CLuc y Cnx1-NLuc, Cnx1E-NLuc o Cnx1G-NLuc. El control negativo reemplazó las construcciones MOT2.1-CLuc con AtPIP2A-CLUc o Cnx1 con NSP3-NLuc. El control de abundancia para representar señales que se originan en interacciones aleatorias consistió en SCYCE-NLuc y reemplazó construcciones Cnx1. El enfoque de interacción y el control negativo o control de abundancia se infiltraron en la mitad de una hoja cada uno. Después de 2 a 7 días de transformación, se infiltraron 6 discos foliares (12 mm de diámetro) por mitad de hoja de 4 hojas de 4 plantas cada uno con solución de luciferina (MES 10 mM, pH 5,6, MgCl2 10 mM, DMSO al 0,5% (v/v). , luciferina 0,1 mM). La luminiscencia se midió como RLU utilizando un lector multimodo Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) a 560 nm durante 20 minutos. El factor Luc dividido del enfoque de interacción se calculó dividiendo la media de los enfoques de interacción con los controles negativos de la otra mitad de la hoja. Los factores de Luc divididos de control de abundancia se calcularon de manera análoga. La interacción tiene lugar cuando el factor Luc dividido del enfoque de interacción es mayor que el factor Luc dividido del control de abundancia.

Todos los experimentos se realizaron con múltiples muestras independientes como se describe en Materiales y métodos y en las leyendas de las figuras. Los experimentos que abordan la localización, la topología de los términos, BiFC, Split-Luc y la tinción con GUS se realizaron varias veces y obtuvieron resultados similares a los reportados aquí. La cinética de crecimiento de Saccharomyces y de las plantas se repite al menos tres veces. Se trazan las medias de experimentos independientes y las barras de error representan la desviación estándar. Como se indica en cada figura/leyenda de tabla, se utilizó la prueba T no pareada para probar la significancia, se utilizaron análisis ANOVA de dos vías y pruebas post hoc de Sidak para comparación múltiple para analizar los datos cuantitativos. No se excluyeron datos de los resultados informados y todas las réplicas biológicas se utilizaron para análisis estadísticos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y en su información complementaria. Los datos numéricos utilizados en el presente trabajo se pueden encontrar en Datos complementarios 1 y están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Queremos agradecer a Mattes Hintmann y al grupo de trabajo de Rebekka Biedendieck de BRICS (TU Braunschweig, Alemania) por su ayuda con el BioLector® y el suministro de platos para flores. Nos gustaría agradecer la ayuda del Prof. Hans Thordal-Christensen (Universidad de Copenhague, Dinamarca) por proporcionar vectores Split-10 + 1-GFP. Las líneas KO de ADN-T de Arabidopsis fueron proporcionadas amablemente por el centro de stock de Arabidopsis de Nottingham (NASC, Nottingham, Reino Unido). Además queremos agradecer al Prof. Dr. Erwin Grill su ayuda con el tema de los metales pesados ​​y el glutatión. También nos gustaría agradecer al grupo de trabajo del Prof. Dr. Christian Hertweck por su gran ayuda con los análisis de espectrometría de masas y por compartir sus instalaciones con nosotros. Nos gustaría agradecer a Nele Fiene, Moritz Friesch, Benedikt Gierling, Linda Hage, Melanie Heidecke, Jannik Heiligenstadt, Rena Hinrichs, Saskia Kell, Eike Kreitz, Jan-Hendrik Lenzen, Samuel Meckoni, Lena Meißner, Paul Meyfarth, Merve Saudhof, Fynn Schilling, Ina Schmidt, Alexa Schubert, Nico Sprotte, Luca Steinbacher, Claudia Strauch, Kaja Tünnermann, Hanna Willenbockel, Jess Arnold Siani Wouachi y Chris Zaydowicz por su ayuda, su alto compromiso y su gran trabajo técnico en nuestro laboratorio. Nuestro agradecimiento especial a nuestras técnicas Kristin Eckhoff y Tanja Linke. Este trabajo fue apoyado financieramente por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención GRK2223/1) para RH y RRM.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Estos autores contribuyeron igualmente: Jan-Niklas Weber, Rieke Minner-Meinen

Instituto de Biología Vegetal, Universidad Técnica de Braunschweig, Humboldtstrasse 1, D-38106, Braunschweig, Alemania

Jan-Niklas Weber, Rieke Minner-Meinen, Maria Behnecke, Thomas W. Hercher, Lena van den Hout, Lars Knüppel, Simon Sivov, Jutta Schulze, Ralf-R. Mendel, Robert Hansch y David Kaufholdt

Instituto de Microbiología y Centro Integrado de Biología de Sistemas de Braunschweig, Universidad Técnica de Braunschweig, Rebenring 56, D-38106, Braunschweig, Alemania

Rebeca Biedendieck

Departamento de Química Biomolecular, Instituto Leibniz de Investigación Natural y Biología de Infecciones (HKI), Beutenbergstrasse 11a, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Friedrich Schiller Jena, D-07743, Jena, Alemania

Veit G. Hänsch y Christian Hertweck

Centro de Ecofisiología Molecular (CMEP), Facultad de Recursos y Medio Ambiente, Universidad del Suroeste, Tiansheng Road No. 2, 400715, Chongqing, Distrito de Beibei, República Popular China

Robert Hansch

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JNW, RMM, RH y DK planificaron y diseñaron el proyecto. RH y RRM adquirieron financiación. RMM, MB y JNW realizaron análisis in silico. TWH, RRM, DK y JNW generaron cepas de levadura. SS, JNW, DK, RH y RB realizaron ensayos de crecimiento de levadura y discutieron los resultados. RMM diseñó y generó vectores para localización, topología y BiFC. JS realizó el aislamiento y transformación de protoplastos. RMM, MB y JNW llevaron a cabo estudios de localización. RMM realizó estudios de topología. RMM y JNW generaron líneas de plantas mot2:gus. Lv.dH llevó a cabo ensayos histoquímicos de GUS. JNW llevó a cabo ensayos fluorimétricos de GUS. Lv.dH y JNW se encargaron del crecimiento hidropónico y del análisis de fenotipo. JNW llevó a cabo ensayos de absorción de molibdato. Lv.dH realizó ensayos de NR. RMM, LK y DK llevaron a cabo análisis BiFC. JNW realizó análisis de espectros UV de complejos de GSH-molibdato. CH y VH llevaron a cabo experimentos de EM. Todos los autores analizaron y discutieron los resultados. JNW y DK participaron principalmente en la redacción del manuscrito. JNW, VH, DK, Lv.dH, LK y RRM elaboraron cifras y tablas. JS, RH y RRM leyeron críticamente el manuscrito y mejoraron el texto; todos los autores lo finalizaron. JNW, DK y RH coordinaron el trabajo. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada de este manuscrito.

Correspondencia a Robert Hänsch.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: David Favero y Manuel Breuer. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Weber, JN., Minner-Meinen, R., Behnecke, M. et al. La familia del transportador de molibdato 2 de Arabidopsis pluriempleo y la formación del complejo GSH facilitan la homeostasis del molibdeno. Común Biol 6, 801 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05161-x

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Recibido: 04 de abril de 2023

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 02 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05161-x

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